Am Prozess vun der Genetescher Studie begéine mir dacks net genuch RNA Echantillon, zum Beispill, fir kleng anatomesch mëndlech Tumoren ze studéieren, souguer Eenzell Proben, a Proben vu spezifesche Genmutatiounen, déi op ganz nidderegen Niveauen a mënschlechen Zellen transkribéiert ginn.Natierlech, fir den COVID-19 Test, wann d'Subs net op der richteger Plaz sinn oder net genuch Zäite wärend der Probe, wäert d'Probegréisst ganz niddereg sinn, dofir ass d'Kommissioun fir Gesondheet a Familljeplanung virun zwee Deeg erauskomm an huet den Test gepackt, a wann den Nukleinsäure-Sampler net sechs Proben geholl huet, kënnt Dir et mellen.
D'Sensibilitéit vum Reagens ass wichteg well mir dëse Problem oder dee Problem hunn, also wat kënne mir maachen fir d'Sensibilitéit vum RT-PCR ze verbesseren?
Ier mir iwwer méiglech Léisungen diskutéieren, loosst eis zwee grouss Komplikatioune mat der Situatioun ernimmen, déi mir just ernimmt hunn.
Als éischt maache mir eis Suergen iwwer RNA Verloscht wa mir nëmmen e puer Zellpopulatiounen an eiser Probe hunn.Wann traditionell Trennung a Botzen Methode benotzt ginn, wéi Kolonn Method oder Nukleinsäure Nidderschlag Method, ass et eng grouss Méiglechkeet, datt déi puer Echantillon verluer ginn.Eng Léisung ass en Trägermolekül ze addéieren, sou wéi tRNA, awer och dann ass et keng Garantie datt eis Erhuelungsexperiment OK ass.
Also wat ass e bessere Wee?Eng gutt Optioun fir kultivéiert Zellen oder mikroanatomesch Proben ass direkt Lysis ze benotzen.
D'Iddi ass d'Zellen fir 5 Minutten opzedeelen, d'RNA an d'Léisung fräiginn, dann d'Reaktioun fir 2 Minutten stoppen, dann d'Lysat direkt an d'Reverse Transkriptiounsreaktioun bäizefügen sou datt keng RNA verluer geet, a schliisslech déi resultéierend cDNA direkt setzen. an d'Echtzäitreaktioun.
Awer wat wa mir, wéinst engem limitéierten Ausgangspunkt oder enger klenger Quantitéit vum Zilgenausdrock, all d'RNA kënne recycléieren an ëmmer nach net genuch Template ubidden fir e gutt Echtzäit Signal ze kréien?
An dësem Fall kann de Pre-amplification Schrëtt ganz nëtzlech sinn.
Déi folgend ass e Schema fir d'Sensibilitéit no ëmgedréint Transkriptioun ze erhéijen.Ier Dir ufänkt, musse mir downstream froen an wéi eng Ziler mir interesséiert sinn, fir spezifesch Primer fir dës Ziler fir Pre-Amplifikatioun ze designen.
Dëst kann erreecht ginn andeems Dir e gemëschte Primer mat bis zu 100 Puer Primer an engem Reaktiounszyklus vun 10 bis 14 Mol erstallt.Dofir ass e Master Mix speziell fir dës Fuerderung entworf gebraucht fir d'cDNA viraus ze verstäerken.
De Grond fir d'Zuel vun den Zyklen tëscht 10 a 14 ze setzen ass datt dës limitéiert Zuel vu Zyklen Zoufällegkeet tëscht de verschiddenen Ziler garantéiert, wat entscheedend ass fir Fuerscher déi quantitativ molekulare Informatioun brauchen.
No der Pre-Amplifikatioun kënne mir eng grouss Quantitéit vun cDNA kréien, sou datt d'Detektiounsempfindlechkeet um Réck-Enn staark verbessert gëtt, a mir kënne souguer d'Probe verdünnen a verschidde Echtzäit PCR-Reaktiounen ausféieren fir méiglech zoufälleg Feeler ze eliminéieren.
Post Zäit: Apr-11-2023